核酸扩增技术有哪些，核酸等温扩增技术有哪些 _核酸

核酸等温扩增技术有哪些

环介导等温扩增技术（LAMP）。依赖于核酸序列的扩增技术（NASBA）。滚环扩增技术（RCA）。单引物等温扩增技术（SPIA）。依赖于解旋酶的等温扩增技术（HAD）。链接代扩增技术（SDA）。快速等温检测放大技术（RIDA）。切刻内切酶核酸恒温扩增技术（NEMA）。
核酸扩增技术有哪些核酸研究技术包括：RT-PCR、基于Cas酶的检测技术（CRISPR/Cas）、高通量测序、环介导等温扩增（LAMP）和荧光原位杂交检测（FISH）等。
RT-PCR

具有快速、准确、灵敏度高等优点，是目前WHO、中国疾控中心等官方指南建议的检测方法。
基于Cas酶的检测技术

该技术目前还处于新兴阶段，该技术可无需特殊仪器辅助，反应体积小又有很高的灵敏度精确度，方法成熟后可扩大通量检测，因而显示出极大的应用发展前景。由于病毒的高变异性，如何提高crRNA靶向识别的特异性、反应的稳定性很是关键。
高通量测序

优势在于高准确性，高通量、高灵敏，检验RT-PCR灰度可疑区的结果，避免RT-PCR由于样本病毒低载量问题、引物或探针结合区存在突变位点导致的假阴性结果，同时还可以鉴定出其他的致病病原体。
环介导等温扩增

环介导等温扩增反应，其操作简单，对仪器设备要求低，结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，其具有反应快速和操作简单的优点。
荧光原位杂交检测

能够在保持细胞、组织完整性的同时能够实现对SARS-CoV-2病毒核酸的定位检测，是对SARS-CoV-2病毒核酸基因检测的有效补充，能够弥补现有荧光定量PCR检测受PCR抑制因素的影响存在一定漏检率的缺陷。
等温扩增核酸的等温扩增是一个简单的过程，可以在恒定温度下快速有效地积累核酸序列。自1990年代初期以来，已开发出各种等温扩增技术来替代聚合酶链反应（PCR）。这些等温扩增方法已用于生物传感目标，例如DNA ， RNA，细胞，蛋白质，小分子和离子。这些技术在原位或细胞内生物成像和测序中的应用已得到充分证明。通过等温扩增方法生产的扩增子也已被用于构建通用的核酸纳米材料，有望用于生物医学，生物成像和生物传感领域。将等温扩增整合到微系统或便携式设备中，可改善基于核酸的现场测定，并具有很高的灵敏度。也已经基于集成的微流体系统实施了单细胞和单分子分析。
聚合酶链反应（PCR）是目前最受欢迎的扩增技术，用于扩增和检测低丰度核酸，已广泛应用于各个领域。但它需要大型且昂贵的热循环仪，这极大地限制了PCR在资源受限的环境中以及在即时医疗点（POC）分析中的应用。
与需要复杂的热循环以介导变性，退火和随后的延伸的PCR相比，等温扩增可以在一个反应温度和简单条件下（例如在水浴中）进行。核酸的等温扩增已成为一种有前途的替代方法，其中在恒定温度下无需PCR所需的热循环即可实现快速有效的扩增。自1990年代初以来，已开发出数十种采用各种扩增机制的等温核酸扩增技术，这些方法中的大多数对核酸的检测具有惊人的灵敏度。至今已经发表了数千项与核酸等温扩增相关的研究。但是核酸的等温扩增的概念，应用和观点尚未得到全面审查。许多等温扩增技术[例如，指数链置换扩增（E-SDA）和超支化滚环扩增（HRCA）]基于DNA复制，其他的则基于基于酶的消化或无酶的核酸组装。我们根据等温扩增技术的反应动力学将其分类：指数扩增，线性扩增和级联扩增。
各种实验室已经开发出十多种等温指数扩增方法。这些主要包括基于核酸序列的扩增（NASBA）， E-SDA ， HRCA，引物生成滚环扩增（PG-RCA），环介导的等温扩增（LAMP），解旋酶依赖性扩增（HDA），重组酶聚合酶扩增（RPA），指数扩增反应（EXPAR）和全基因组扩增（WGA）。这些扩增方法中的大多数（例如，NASBA，E-SDA ， LAMP，HDA和RPA）使用两种或多种引物扩增核酸模板，而其他诸如HRCA，PG-RCA和EXPAR的引物则利用一种功能模板来扩增核酸模板。此外，尽管HRCA和LAMP仅使用DNA聚合酶即可实现指数扩增，但其他方法则需要其他酶或蛋白质。重要的是，这些方法都具有与PCR相当的高扩增效率。表1提供了不同等温扩增技术的比较。
【核酸扩增技术有哪些，核酸等温扩增技术有哪些】链置换扩增（SDA）利用两个外部“凸块”引物和两个内部5'尾部区域引物，其中包含一个切口酶识别位点。与切口酶（例如，Nt.BstNBI）一起，离散DNA产物的扩增以快速的方式发生。
NASBA在40℃的较低温度下进行，导致特异性降低。E-SDA使用两个或什至四个引物克服了这一缺点，但是必须针对DNA聚合酶和NEase对该缓冲液进行优化。HRCA仅使用聚合酶，但始终需要在扩增前进行额外的连接过程才能特异性识别靶标。为了提高序列特异性并简化扩增系统，LAMP最初是由Notomi及其同事在2000年提出的。环介导的等温扩增（LAMP）使用4-6个引物，识别目标DNA的6-8个不同区域。置换链的DNA聚合酶启动合成，其中2个引物形成环结构，以促进随后的扩增
与PCR相反，上述等温扩增方法不能扩增更长的DNA靶标，例如千碱基（kb）区域，这在许多基础研究和诊断应用中是必需的。为了克服这些缺点，HDA于2004年设计出了模仿DNA复制的技术。在体内， DNA通过DNA聚合酶复制，并且各种辅助蛋白（包括DNA解旋酶）被用于分离DNA双链体。在HDA中，DNA解旋酶也用于分离目标dsDNA，并生成用于引物杂交和随后通过DNA聚合酶延伸的sstemplates（图1F）。HDA反应是一个三步循环过程（模板分离，引物杂交和引物延伸），类似于PCR 。但是，dsDNA不会通过DNA解旋酶解链，而不是通过PCR中的热循环步骤解链。通过在一个温度下同时进行链反应，可以实现靶序列超过百万倍的扩增。在第一版HDA中，由于大肠杆菌UvrD解旋酶的热不稳定性，反应温度为37℃ 。热稳定蛋白的开发使得能够在更高的温度（60-65℃）下更快地扩增，并提高了对病原体和SNP检测的灵敏度和特异性。商业HDA试剂盒可从BioHelix Corporation获得
重组酶聚合酶扩增（RPA）和基于链入侵的扩增（SIBA）是等温扩增方法，可通过重组酶的活性来实现，该酶可帮助引物侵入双链DNA 。T4 UvsX与它的辅助蛋白UvsY和单链结合蛋白gp32结合使用，形成D环重组结构，用于通过Bsu或其他变温链置换DNA聚合酶引发扩增。RPA使用两个寡核苷酸作为正向和反向引物，例如“等温PCR” ，而SIBA还包括更长的侵入寡核苷酸，以帮助促进链的侵入和扩增。独特的是，在等温方法中，RPA可以产生高达1 kb（引物间距离）的扩增子。尽管非特异性扩增可能是一个普遍的挑战，但RPA和SIBA都通常在?37°C下进行，避免了其他方法的较高温度。探针可与两种方法一起使用以检测特定的产品。除了诊断扩增应用外，基于重组酶的扩增还显示了在下一代测序工作流程中用于克隆扩增的效用
全基因组扩增（WGA）是表示旨在扩增整个基因组的方法的总称，通常从低量（皮克级到纳克级）的DNA开始，最多产生数十微克量的扩增产物。WGA已成为利用有限数量的珍贵原料样品或实现单细胞基因组DNA测序的宝贵方法。
MDA过程从与DNA模板结合的随机六聚体引物开始。置换链的聚合酶（通常是phi29 DNA聚合酶）启动扩增，最终结果是长而分支的DNA网络。如果DNA产物将用于下游应用，则可以使用T7核酸内切酶1解析分支。
已经开发出了几种用于高保真全基因组扩增的方法，包括基于PCR的方法，例如简并寡核苷酸PCR（DOP-PCR）和引物延伸预扩增（PEP），但是最常用的方法是多置换扩增（MDA）。该方法利用了phi29或Bst等DNA聚合酶的链置换活性。
对于带有phi29 DNA聚合酶的MDA，将高浓度（10–50μM）的随机六聚体与模板材料和phi29混合，并根据需要的扩增水平孵育1–12小时。phi29的校对核酸外切酶活性可确保模板DNA的高保真复制，但还需要六聚体引物中的硫代磷酸酯键才能实现高效。对于高产率的反应，可以包括焦磷酸酶，以避免产生高浓度焦磷酸副产物而抑制聚合酶。反应产物非常长（> 30 kb），并通过多重置换机制高度分支。对于下一代测序应用，声波剪切或NEBNext Fragmentation System可以将这些产物解析为可读片段，这是文库制备工作流程的一部分。当将这些产品用于其他下游应用（如纳米孔测序）时，可以使用T7核酸内切酶1解析分支。
尽管指数扩增技术提供了高扩增效率和检测灵敏度，但它们遭受了快速的非特异性扩增和复杂设计的困扰。相反，线性扩增策略更方便，并且排除了非特异性扩增的干扰。尽管测定灵敏度相对较低，但它们仍适合潜力无限的各种应用。
线性SDA仅使用一个引物引发。与E-SDA的双向特性相反，其扩增过程（切口和聚合/置换）是单向的，累积了数千个目标拷贝。通过设计靶标特异性发夹型荧光探针，开发了一种类似的方法，即圆链置换聚合反应，以在1000 s内达到ssDNA靶标的检测限6.4×10-15M 。这些线性方法已应用于多个目标的检测。
RCA产生长的重复靶序列的ssDNA 。以这种线性格式，HRCA中不需要第二个引物，并且核酸合成是由HRCA中的Phi 29 DNA聚合酶而不是Vent exo-DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶催化的。RCA（?37℃）的反应温度低于HRCA（?60℃）的反应温度。RCA在1小时内达到了约103倍的扩增，并且可以通过添加ssDNA结合蛋白进一步提高效率。除生物分析应用外，RCA还被用于纳米生物医学，纳米技术，和材料科学中。用RNA聚合酶替代Phi 29 DNA聚合酶，使滚环转录（RCT）成为可能。合成具有重复序列的长RNA链，有望在RNA干扰（RNAi）中得到应用。
核酸测序扩增（NASBA）和转录介导扩增（TMA）是通过RNA进行的类似等温扩增技术。尽管DNA主要用于RNA检测，但也可以用作起始材料。设计引物以靶向目标区域为目标，但重要的是，一种引物在5'端包括T7 RNA聚合酶的启动子序列。这使得能够产生单链RNA物质，其通过反应中包括的逆转录酶被逆转录成cDNA 。DNA-RNA杂种中的RNA被RNase H活性破坏（来自NASBA中的外源蛋白质，或被TMA中的RNase H + RT破坏），而dsDNA由RT产生。然后，该模板通过T7 RNAP和指数扩增结果转录为RNA 。
尽管线性扩增策略既方便又快速，但受到信号增益低和检测灵敏度低的限制。为了克服这些限制，已经开发了整合两种或更多种扩增方法的技术。这种所谓的“级联放大”表现出与某些指数放大技术相当的灵敏度。级联扩增的关键要求是上游方法的产物充当下游方法的触发器，因此充当连接这些模块的“桥梁” 。
与dsDNA相比，ssDNA在级联扩增的设计上更具通用性。具有积累数千种ssDNA产物的能力，SDA已广泛应用于不同的级联扩增策略。2006年，Willner和同事首次提出了SDA / DNAzyme组合级联扩增的方法，方法是设计一个独特的DNAzyme生成模板。产生了数千个DNAzyme分子，每个分子都可以氧化许多底物分子，从而产生放大的光学信号。因此，实现了级联信号放大。金属离子依赖性DNA酶随后与SDA结合用于级联裂解反应。这种类型的级联策略已应用于各种生物传感器的构建。值得注意的是，前一种方法需要在核酸扩增后产生信号的其他步骤，而后一种方法需要在DNA探针中修饰核糖核苷酸。
除DNA酶外，核酸酶也已整合到SDA中以进行级联扩增。Xia等人通过合并λExo（λExo）。他们开发了一种称为发夹介导的二次酶扩增（HQEA）的一步法。HQEA结合了靶标循环的杂交反应和随后的循环裂解反应，对单细胞水平的microRNA（miRNA）分析显示出很高的敏感性。
NEase最初用于SDA代替Exo，NEase辅助方法与SDA的集成应可导致简单的传感系统，而无需优化反应缓冲液。我们的团队通过开发酶协同等温二次DNA机器（ESQM）证实了这一假设。该DNA机器利用专门设计的发夹探针和两个功能部分来桥接这些方法，并且可以在SDA反应条件下进行级联扩增。ESQM的信号增强明显高于SDA 。Ye等人设计了一种相关方法。此外，我们提出了另一种结合了SDA的级联扩增反应，而没有引入额外的酶来创建三重SDA过程。第一个SDA的产物循环诱导下一个SDA，并且产物回收过程等效于一个SDA过程。该方法在SDA反应条件下可获得明显更高的放大信号。
不同的研究小组还提出了其他几种结合了SDA的级联扩增策略。这些方法将级联扩增过程分为两个独立的反应步骤，这延长了测定时间，并使操作复杂化。
与SDA相似，RCA产生ssDNA产物，并已与其他扩增方法广泛结合。在2007年，Willner和同事开发了RCA / DNAzyme级联扩增，其中合成了长的DNAzyme链以进行第二次扩增反应。已经使用该级联扩增设计了几种生物传感器。目标序列回收的RCA（TR-RCA）和树状RCA也已被设计为RCA级联。在TR-RCA中，哑铃式挂锁探针旨在识别靶序列以激活由过量引物触发的RCA 。然后，该RCA过程将目标移开，以激活下一个RCA过程。因此，级联RCA是通过回收靶序列来实现的。在树状RCA中，发夹结构是关键要素。它可以与靶标引发的RCA产物杂交，从而导致释放新的靶标序列。该释放的靶序列在发夹结构中诱导了新的RCA过程，从而导致级联扩增。通过一步扩增反应，这三种级联策略均可提供显着扩增的信号
还已经报道了RCA结合了级联扩增策略以及结合了核酸酶辅助扩增方法的多个反应步骤。Smith和他的同事们设计了第一种方法，该方法基于FEN催化的侵入性切割，然后进行RCA 。表面上人类基因组DNA的两步扩增为SNP分析提供了足够的灵敏度。其他两种核酸酶（NEase和Exo）也已用于开发RCA组合级联扩增。最近证明了一种基于RCA的生物传感器，将无酶CHA与两个单独的扩增反应偶联。尽管需要多个反应步骤，但这些级联方法仍具有很高的测定灵敏度。
前面提到的级联扩增方法涉及聚合酶催化的DNA合成。不含聚合酶的级联技术也已建立。在FEN辅助侵袭方法发展一年后，通过在同质测定中耦合两个侵袭反应，提出了串行侵袭信号放大反应（SISAR）.这种级联版本可在4个分子内为每个靶DNA产生107个以上的报告分子。FEN辅助的侵入式方法也与NEase辅助的方法结合用于级联酶促信号扩增（CESA）。除了FEN之外，其他核酸酶也可用于序列扩增和循环扩增。Nuclease / DNAzyme-还已经证明了利用级联方法，和相继设计了几种基于HCR和CHA的无酶级联
等温扩增也可以通过信号扩增来实现，而无需依赖新核酸产物（DNA或RNA）的产生。与采用聚合酶的方法相反，这些方法受焦磷酸盐的积累抑制，这些信号放大策略不受产物抑制。基于信号放大机制，这些策略可分为三种类型：核酸酶辅助，DNAzyme辅助和无酶反应。
核酸酶可以切割核酸的磷酸二酯键，并且包括切割DNA的脱氧核糖核酸酶（DNase）和切割RNA的核糖核酸酶（RNase），并且可以进一步分类为Exos和Endos 。通常，核酸酶辅助策略涉及回收由不同核酸酶催化的核酸裂解，例如襟翼内切核酸酶（FEN），NEase，双工特异性核酸酶（DSN），REase，Exos，DNase I ，和RNase H，NEase辅助方法和Exo辅助方法被广泛使用，并且基于FEN的方法（入侵者或侵入性测定法）已通过Third Wave Technologies商业化用于SNP基因分型和病毒检测。
在DNA核酶辅助方法中，金属离子依赖性DNA核酶通常用于进行核酸切割。DNA酶是可催化化学反应并通过在金属离子（例如Mg2+和Pb2 +）存在下形成致密结构而被激活的DNA分子。通过三个步骤（激活，切割和周转）实现了丰富的扩增，为不同的分析物提供了出色的传感性能.具有模仿过氧化酶活性的过氧化物酶的G四联体DNA酶也已被用于通过催化氧化来催化快速信号放大。在这种特殊的DNA酶的基础上，开发了比色，荧光，化学发光（CL），和电化学生物传感应用。
在无酶方法中，既不使用蛋白质酶也不使用DNA酶。代替循环裂解反应，扩增反应仅涉及杂交过程。Pierce和Dirks在2004年提出了第一个无酶方法，即杂交链反应（HCR）。在HCR中，设计了两个具有相同发夹结构（长茎和短环）的部分互补单体DNA构建块（图A）。在没有靶标的情况下，由于势能在长茎保护下的短环中储存，因此杂交反应无法在室温下进行。靶标ssDNA触发交替（两个发夹物种）杂交的链反应，产生长切口的共聚物。该方法将触发的DNA自组装引入纳米结构，并利用DNA作为生物传感和生物成像的放大换能器。另一种无酶信号放大方法是催化发夹装配（CHA），这是通过DNA的模块化电路实现的。杂交（自组装和拆卸）而不是连锁反应（图B），并导致目标和分析形式（荧光，比色和电化学信号）的多样性
由于操作方便和扩增效率高，等温扩增技术已成为生物分析应用中非常有希望的PCR替代方法。最初，通过这些技术成功地证明了核酸（DNA和RNA）检测，SNP基因分型，甚至DNA甲基化分析。随着分子生物学的发展以及适体，抗体和DNA酶的使用，这些方法已广泛用于其他分析物的生物传感，包括蛋白质，细胞，小的生物分子甚至离子。还已经证明了通过几种等温方法进行的原位和细胞内成像。
[1] Zhao Y, Chen F, Li Q, et al. Isothermal amplification of nucleic acids[J]. Chemical reviews, 2015, 115(22): 12491-12545.
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