分子克隆是将目的基因用体外重组方法将它们插入克隆载体 ， 形成重组克隆载体 ， 通过转化与转染的方式 ， 引入细胞 ， 筛选重组子 ， 经测序验证后 ， 转染至合适的表达细胞 ， 进行稳定表达或瞬时表达 ， 再进行表达的分析和鉴定 。一般PCR扩增经过30～35个循环 ， 可将长度2kb的DNA从原来的1pg扩增到0.3-1g ， 这样的产量可以满足大多数分子克隆实验操作的要求 。
分子克隆实验中目的基因如何获取？
分子克隆是将目的基因用体外重组方法将它们插入克隆载体 ， 形成重组克隆载体 ， 通过转化与转染的方式 ， 引入细胞 ， 筛选重组子 ， 经测序验证后 ， 转染至合适的表达细胞 ， 进行稳定表达或瞬时表达 ， 再进行表达的分析和鉴定 。下面BioArt小编将为您介绍如何获得目的基因以进行后续的操作 。目的基因的获取有下面几种方式：①鸟枪法：用限制性内切酶将供体细胞中的DNA 切成许多片段 ， 将这些片段分别载入运载体 ， 然后通过运载体分别转入不同的受体细胞 ， 让供体细胞所提供的DNA（外源 DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制 ， 从中找出含有目的基因的细胞 ， 再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来 。
用"鸟枪法"获取目的基因的优点是操作简便 ， 缺点是工作量大 ， 具有一定的盲目性 。②染色体DNA的限制性内切酶酶解：Ⅱ型限制性内切酶可专一性地识别并切割特定的DNA顺序 ， 产生不同类型的DNA末端 。若载体 DNA与插入的DNA片段用同一种内切酶消化 ， 或靶DNA与载体 DNA末端具有互补的黏性末端 ， 可以直接进行连接 。
③人工体外合成：简短的目的基因可在了解 DNA一级结构或多肽链氨基酸的一级结构编码的核苷酸序列的基础上人工合成 。④用逆转录酶制备DNA：大多数目的基因是由mRNA合成cDNA得到的 ， 从RNA 入手 ， 先从细胞提取总 RNA ， 然后根据大多数真核 mRNA含有多聚腺嘌呤（polyadenylic acid ， polyA）尾的特点 ， 用寡聚dT纤维素柱将mRNA分离出来 ， 以mRNA为模板 ， 在多聚A尾上结合12～18个dT的寡聚dT片段 ， 作为合适的起始引物 ， 在逆转录酶的作用下合成第一条目的 DNA链 。
用碱或RNA酶水解除去mRNA ， 再用 DNA 聚合酶 ， 最好是Klenow片段合成第二条DNA 链 。双链合成后 ， 用S1核酸酶切去发夹结构 ， 即可获得双链cDNA 。cDNA用于探针制备、序列分析、基因表达等研究 。⑤PCR技术：PCR扩增类似于DNA的天然复制过程 ， 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物 。
PCR（聚合酶链式反应）用于扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段 ， 在由 DNA 聚合酶催化的一系列合成反应中 ， 使用了两段寡核苷酸作为反应的引物 ， 一般情况下 ， 这两段寡核苷酸引物的序列是互不相同的 ， 并分别与模板DNA进行加热变性 ， 随之 ， 将反应混合冷却至某一温度 ， 这一温度可使引物与它的靶序列发生退火 。此后 ， 退火引物在DNA聚合酶的作用下得到延伸 ， 如此反复进行高温变性、低温退火、中温 DNA合或这一循环 。
由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板 。所以 ， 每完成一个循环 ， 就可使目的DNA产物增加1倍 。多轮扩增的结果是使目的DNA片段以指数方式迅速积累 。一般PCR扩增经过30～35个循环 ， 可将长度2kb的DNA从原来的1pg扩增到0.3-1g ， 这样的产量可以满足大多数分子克隆实验操作的要求 。PCR也是实验室用的最多的方法 。
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