1 逆转录buffer 2 μl
2 上游引物 0.2 μl
3 下游引物 0.2 μl
4 dNTP 0.1 μl
5 逆转录酶MMLV 0.5 μl
6 DEPC水 5 μl
7 RNA模版 2 μl
8 总体积 10 μl
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心 。
2. 混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 μl，37℃水浴60分钟 。
3. 取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用 。
四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
1. β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μl按10倍稀释（加水27 μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用 。
2. 反应体系如下：
标准品反应体系
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 μl
2 阳性模板上游引物F 0.5 μl
3 阳性模板下游引物R 0.5 μl
4 dNTP 0.5 μl
5 Taq酶 1 μl
6 阳性模板DNA 5 μl
7 ddH2O 32.5 μl
8 总体积 50 μl
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心 。
3. 管家基因反应体系：
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 μl
2 内参照上游引物F 0.5 μl
3 内参照下游引物R 0.5 μl
4 dNTP 0.5 μl
5 Taq酶 1 μl
6 待测样品cDNA 5 μl
7 ddH2O 32.5 μl
8 总体积 50 μl
轻弹管底将溶液混合，6000 rpm短暂离心 。
3. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环 。
五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
1. 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应 。
2. 反应体系
序号 反应物 剂量
1 10× PCR缓冲液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 上游引物F 0.5 ul
4 下游引物R 0.5 ul
5 dNTP混合液 3 ul
6 Taq聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至总体积为 25 ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心 。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72?C延伸5分钟 。
（3）PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带 。
（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度 。
六、 待测样品的待测基因实时定量PCR
1. 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系 。
2. 体系配置如下：
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1 ul
3 下游引物 1 ul
【pcr技术原理和三个主要步骤】4 dNTP 1 ul
5 Taq聚合酶 2 ul
6 待测样品cDNA 5 ul
7 ddH2O 30 ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心 。
（3）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应 。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸 。
七、 实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) 。
八、电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应 。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带 。
注意事项：
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