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从浙江选考命题角度解读“原生质体”的疑难问题

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从浙江选考命题角度解读“原生质体”的疑难问题
严灵剑（浙江省象山中学 象山 315700）
摘 要本文从原生质体的获取、纯化、培养、分裂和活性鉴定五个方面，深入解读了近几年浙江选考题中涉及原生质体的疑难问题 。
关键词浙科版 原生质体 教学疑难
原生质体研究的热潮开始于20世纪80年代早期，并在随后的几年中对原生质体的研究逐步深入，目前包括园艺植物在内的近400种植物已成功实现原生质体的分离 。在浙江省的选考试题中也经常原生质体，主要涉及获取、纯化、培养、分裂和活性鉴定等五个方面，下面笔者就相关内容和大家交流一下 。
1 原生质体是否一定要用纤维素酶和果胶酶来获取？
原生质体分离常用的酶有果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶 。一般来说，分离叶肉细胞和悬浮细胞的原生质体时只需纤维素酶和果胶酶即可 。纤维素酶消化细胞壁的纤维素，果胶酶主要用于分解胞间层中的果胶，促使细胞的分离 。分离愈伤组织原生质体时，加上半纤维酶来降解细胞壁中的半纤维素，效果会更好，酶的用量和酶解时间需适当增加 。[1]由此可见，原生质体的取材来源，直接决定了所需酶的种类 。
【选考真题】（2016年浙江选考T32）（节选）（1）原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5mol/L甘露醇（维持较高渗透压）的纤维素酶和果胶酶的混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体 。
【分析】这题是从叶片进行处理来获得原生质体，类似于从叶肉细胞中分离原生质体，所以要加纤维素酶和果胶酶 。
2 原生质体为什么要纯化及如何纯化？
细胞酶解后的混合物中，除完整未损伤的原生质体外，还含有许多杂质，如细胞碎片、叶绿体、维管束成分、未被消化的细胞组织和破裂的原生质体 。因而必须把这些杂质除掉 。清除较大碎屑的方法是使酶解后的混合物穿过一个50~70mm的镍丝网进行过滤 。然后再利用密度，通过多次离心，取某一界面物或是除去上清液，进一步纯化 。最后获得纯净的原生质体 。[2]由此可见，酶解后的混合物经过过滤、离心等纯化步骤后，才能获得我们想要的原生质体 。
【选考真题】（2016年浙江选考T32）（节选）（1）原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5mol/L甘露醇（维持较高渗透压）的纤维素酶和果胶酶的混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体 。
【分析】在获取原生质体的过程中会混有杂质，可以通过过滤初步纯化，再通过离心进一步纯化 。
3 原生质体培养过程中何时降低渗透压？
在原生质体还没有再生出一个坚韧的细胞壁之前，它必须有培养基渗透压的保护 。培养基中的渗透压一般是用0.5~0.6mol/L甘露醇或山梨醇调节的 。培养开始后7~10d,大部分有活力的原生质体已经再生出细胞壁并进行了几次分裂，此后通过定期加入几滴不含渗压剂或渗压剂水平很低的新鲜培养基，可使培养基的渗透压逐渐下降（若还把渗压剂保持在原来的高水平上，若干时间以后细胞就会停止分裂） 。最后将肉眼可见的细胞团转入到不含渗压剂的新鲜培养基中 。[3]由此可见，原生质体培养基中的渗透压应该在细胞分裂几次后，用渗透压相对较低的渗压剂来降低培养基中的渗透压，直至用不含渗压剂的新鲜培养基来培养细胞团 。
【选考真题】（2016年浙江选考T32）（节选）（2）原生质体的培养：将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞 。此时，应该降低 培养基中的甘露醇浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后经两条途径形成再生植株 。

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