7、弃二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次.
8、加入显色液,避光显色出现条带时放入双蒸水中终止反应.
四、注意事项
1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定条件.
2、显色液必须新鲜配置使用,后加入H2O2.
3、DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细.
western blot实验步骤western blot实验操作步骤如下：
1. 准备样品
1）制冰，准备冰盒 。
2）配制细胞裂解液：根据细胞数量确定所需裂解液：50ul/六孔板一孔。
裂解液配方：100ul碧云天裂解液+1ul蛋白酶抑制剂混合物+1ul PMSF
3）按实验需要准备好细胞：去掉培养基，1×PBS洗3次（去掉培养基中的血清），每个孔（6孔板）加入适量的裂解液 。迅速用细胞刮刮下细胞并转移1.5ml管中，置于冰上20min，振荡混合后，再置冰上10min 。
2. SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳：制备分离胶（5ml/gel）
3. 膜转移
1) 切胶，按Marker指示和目的条带的位置切胶(注意将胶切角做记号)，将洗脱的胶浸入转膜缓冲液中15分钟 。
2) PVDF膜做好记号后先浸入甲醇中1分钟，再连同4张3mm滤纸和海绵浸入转移缓冲液中15分钟 。
好了，关于westernblot和westernblotting的问题到这里结束啦，希望可以解决您的问题哈！
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